Una mutazione spontanea è una mutazione che si verifica in condizioni naturali quando la causa diretta della mutagenesi non è stata identificata.
Le mutazioni spontanee si verificano costantemente nelle cellule degli organismi, anche senza esposizione a fattori mutageni. Sono una conseguenza di errori durante la replicazione del DNA, errori nel funzionamento degli enzimi di riparazione del DNA, trasformazioni chimiche spontanee dei nucleotidi e altri processi che avvengono naturalmente nella cellula.
L'incidenza delle mutazioni spontanee è solitamente molto bassa, dell'ordine di 10^{ -5}-10^{ -8} per gene per generazione. Tuttavia, nella somma del genoma di un organismo, le mutazioni spontanee danno un contributo significativo alla variabilità dei tratti nelle popolazioni.
La maggior parte delle mutazioni spontanee sono letali o neutre per l'organismo. Meno spesso portano all'emergere di nuovi tratti utili. Tuttavia, la mutagenesi spontanea è considerata la principale fonte di variazione genetica nelle popolazioni naturali e un fattore importante nell'evoluzione.