Eine spontane Mutation ist eine Mutation, die unter natürlichen Bedingungen auftritt, wenn die direkte Ursache der Mutagenese nicht identifiziert wurde.
In den Zellen von Organismen kommt es ständig zu spontanen Mutationen, auch ohne Einwirkung mutagener Faktoren. Sie sind eine Folge von Fehlern bei der DNA-Replikation, Fehlern in der Funktion von DNA-Reparaturenzymen, spontanen chemischen Umwandlungen von Nukleotiden und anderen Prozessen, die auf natürliche Weise in der Zelle ablaufen.
Die Häufigkeit spontaner Mutationen ist normalerweise sehr gering und liegt in der Größenordnung von 10^{ -5}-10^{ -8} pro Gen und Generation. In der Gesamtheit des Genoms eines Organismus tragen spontane Mutationen jedoch erheblich zur Variabilität von Merkmalen in Populationen bei.
Die meisten spontanen Mutationen sind für den Organismus tödlich oder neutral. Seltener führen sie zur Entstehung neuer nützlicher Eigenschaften. Allerdings gilt die spontane Mutagenese als Hauptquelle genetischer Variation in natürlichen Populationen und als wichtiger Faktor in der Evolution.