Southern Blot Ανάλυση

Η ανάλυση κηλίδας Southern είναι μια μέθοδος για τον εντοπισμό συγκεκριμένων μορφών DNA στα κύτταρα. Αναπτύχθηκε από τον Βρετανό βιολόγο Edwin Southern το 1975.

Σε αυτή τη μέθοδο, τα μόρια DNA αρχικά εξάγονται από κύτταρα και στη συνέχεια κόβονται σε μικρά θραύσματα χρησιμοποιώντας περιοριστικές ενδονουκλεάσες. Αυτά τα θραύσματα DNA διαχωρίζονται χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση γέλης αγαρόζης.

Στη συνέχεια, τα θραύσματα DNA μεταφέρονται στη μεμβράνη χρησιμοποιώντας τριχοειδές στύπωμα. Στη συνέχεια χρησιμοποιείται ένας ραδιοσημασμένος ή φθορισμός επισημασμένος με βαφή ανιχνευτής DNA που είναι συμπληρωματικός προς την ακολουθία DNA που εξετάζεται. Αυτός ο ανιχνευτής υβριδοποιείται με συμπληρωματικά θραύσματα DNA στη μεμβράνη.

Μετά τον υβριδισμό, η θέση του ανιχνευτή στη μεμβράνη προσδιορίζεται με αυτοραδιογραφία ή φθορισμό, που καθιστά δυνατή την ταυτοποίηση της επιθυμητής αλληλουχίας DNA μεταξύ των διαχωρισμένων θραυσμάτων.

Έτσι, η κηλίδωση Southern επιτρέπει σε κάποιον να ανιχνεύσει την παρουσία συγκεκριμένων αλληλουχιών DNA στο γονιδίωμα των κυττάρων ή των ιστών που μελετώνται.

Συγκριτικά, υπάρχουν παρόμοιες μέθοδοι αναγνώρισης RNA (Northern blotting) και πρωτεϊνών (Western blotting).

Η ανάλυση Southern Blot είναι μια μέθοδος που χρησιμοποιείται για την ανίχνευση συγκεκριμένων μορφών DNA σε κύτταρα. Αυτή η μέθοδος αναπτύχθηκε από τον Edward Southern το 1975 και έκτοτε έχει γίνει μια από τις πιο συχνά χρησιμοποιούμενες μεθόδους στη μοριακή βιολογία.

Η αρχή της μεθόδου είναι ότι τα μόρια DNA εξάγονται από κύτταρα και κόβονται σε πολλά μικρά θραύσματα χρησιμοποιώντας περιοριστικά ένζυμα. Αυτά τα θραύσματα στη συνέχεια διαχωρίζονται κατά μέγεθος χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα αγαρόζης. Τα προκύπτοντα θραύσματα DNA μεταφέρονται σε μια νιτροκυτταρίνη ή άλλη μεμβράνη, η οποία στη συνέχεια υποβάλλεται σε επεξεργασία με έναν ειδικό ανιχνευτή γονιδίου. Ένας ανιχνευτής γονιδίου είναι μια σύντομη αλληλουχία νουκλεοτιδίων που δεσμεύεται ειδικά σε μια συγκεκριμένη περιοχή του DNA. Μετά τον υβριδισμό της μεμβράνης με τον ανιχνευτή γονιδίου, αφαιρείται οποιοσδήποτε απομένον μη υβριδισμένος ανιχνευτής, αφήνοντας μόνο τα υβριδισμένα θραύσματα DNA στη μεμβράνη.

Η αυτοραδιογραφία ή η μικροσκοπία φθορισμού χρησιμοποιείται για τον προσδιορισμό της παρουσίας μιας συγκεκριμένης μορφής DNA σε μια μεμβράνη. Στην περίπτωση της αυτοραδιογραφίας, η μεμβράνη επικαλύπτεται με ένα στρώμα φωτογαλακτώματος, το οποίο στη συνέχεια εκτίθεται σε φιλμ. Στην περίπτωση μικροσκοπίας φθορισμού, εφαρμόζονται ειδικές φθορίζουσες ετικέτες στη μεμβράνη, οι οποίες συνδέονται με υβριδισμένα θραύσματα DNA.

Αυτή η μέθοδος έχει πολλά πλεονεκτήματα σε σχέση με άλλες μεθόδους, όπως η στύπωση Northern και η στύπωση Western. Για παράδειγμα, χρησιμοποιώντας το Southern blotting, μπορείτε να προσδιορίσετε την παρουσία συγκεκριμένων μορφών DNA στο γονιδίωμα ενός οργανισμού, καθώς και τη θέση και την ποσότητα τους. Επιπλέον, αυτή η μέθοδος μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό του μεγέθους του γονιδιώματος, της δομής του γονιδίου και πολλών άλλων χαρακτηριστικών του DNA.

Συμπερασματικά, το Southern blotting είναι μια ισχυρή τεχνική για τη μελέτη του DNA και μπορεί να χρησιμοποιηθεί σε πολλούς τομείς της μοριακής βιολογίας, συμπεριλαμβανομένης της γενετικής, της ανοσολογίας, της ογκολογίας και άλλων.

Η ανάλυση Southern blot είναι μια μέθοδος για τον εντοπισμό συγκεκριμένων μορφών DNA σε κύτταρα και χρησιμοποιείται στη μοριακή βιολογία για την ανάλυση γενετικών παραλλαγών. Βασίζεται στον διαχωρισμό των μορίων του DNA σε θραύσματα με τη χρήση περιοριστικών ενζύμων και στην επακόλουθη ανίχνευση πανομοιότυπων τμημάτων χρησιμοποιώντας έναν ανιχνευτή.

Για να πραγματοποιηθεί η κηλίδωση Southern, τα κύτταρα λύονται πρώτα και το DNA διαχωρίζεται από τα κυτταρικά συστατικά. Το DNA στη συνέχεια διαχωρίζεται σε θραύσματα χρησιμοποιώντας περιοριστικά ένζυμα. Τα θραύσματα DNA μεταφέρονται σε μια μεμβράνη νιτροκυτταρίνης, η οποία χρησιμεύει ως φορέας για τον ανιχνευτή. Ο ανιχνευτής μπορεί να είναι ραδιενεργός, φθορισμός ή σημασμένος με βιοτίνη και συνδέεται με DNA που περιέχει συγκεκριμένες αλληλουχίες.

Μετά από αυτό, η μεμβράνη μεταφέρεται σε ένα πήκτωμα που περιέχει θραύσματα DNA που είχαν προηγουμένως εφαρμοστεί σε αυτήν. Τα θραύσματα DNA διαχωρίζονται στο πήκτωμα με βάση το μέγεθός τους και οι ζώνες που αντιστοιχούν σε θραύσματα DNA που συνδέονται με ανιχνευτή ανιχνεύονται με χρώση.

Το Southern blotting χρησιμοποιείται για την ανίχνευση γενετικών παραλλαγών όπως μεταλλάξεις, πολυμορφισμούς και ενισχύσεις. Μπορεί επίσης να χρησιμοποιηθεί για τον προσδιορισμό της γονιδιακής έκφρασης σε διαφορετικούς ιστούς και ως απόκριση σε διαφορετικά ερεθίσματα.

Σε αντίθεση με άλλες μεθόδους στύπωσης (π.χ. στύπωμα Northern και Western), το στύπωμα Southern έχει υψηλή ειδικότητα και ευαισθησία και μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανάλυση μικρών ποσοτήτων DNA. Αυτό το καθιστά χρήσιμο εργαλείο για τη μελέτη της ανθρώπινης γενετικής, της ιατρικής γενετικής και άλλων τομέων της επιστήμης που περιλαμβάνουν τη μελέτη του DNA.