Kallsterilisering (lat. sterilisatio frigida) är en steriliseringsmetod som bygger på användning av låga temperaturer. Med denna metod dör mikroorganismer eller förlorar sin förmåga att fortplanta sig till följd av frysning.
Kallsterilisering utförs oftast med flytande kväve eller torris (fast koldioxid) vid en temperatur av -70-80°C. Sådana låga temperaturer orsakar bildandet av iskristaller i mikroorganismernas celler, vilket leder till deras död.
Fördelarna med metoden är frånvaron av kemikalierester och de negativa effekterna av höga temperaturer. Kallsterilisering har dock begränsad användning eftersom inte alla material och utrustning tål så låga temperaturer. Metoden är effektiv för sterilisering av termolabila ämnen och material.