Kylmästerilointi (lat. sterilisatio frigida) on alhaisten lämpötilojen käyttöön perustuva sterilointimenetelmä. Tällä menetelmällä mikro-organismit kuolevat tai menettävät lisääntymiskykynsä jäätymisen seurauksena.
Kylmästerilointi suoritetaan useimmiten nestemäisellä typellä tai kuivajäällä (kiinteä hiilidioksidi) lämpötilassa -70-80°C. Tällaiset alhaiset lämpötilat aiheuttavat jääkiteiden muodostumista mikro-organismien soluissa, mikä johtaa niiden kuolemaan.
Menetelmän etuja ovat kemiallisten jäämien puuttuminen ja korkeiden lämpötilojen negatiiviset vaikutukset. Kylmästeriloinnin käyttö on kuitenkin rajallista, koska kaikki materiaalit ja laitteet eivät kestä niin alhaisia lämpötiloja. Menetelmä on tehokas lämpölabiilien aineiden ja materiaalien sterilointiin.