Koude sterilisatie (lat. sterilisatio frigida) is een sterilisatiemethode gebaseerd op het gebruik van lage temperaturen. Met deze methode sterven micro-organismen af of verliezen ze hun voortplantingsvermogen als gevolg van bevriezing.
Koude sterilisatie wordt meestal uitgevoerd met behulp van vloeibare stikstof of droogijs (vast kooldioxide) bij een temperatuur van -70-80°C. Dergelijke lage temperaturen veroorzaken de vorming van ijskristallen in de cellen van micro-organismen, wat tot hun dood leidt.
De voordelen van de methode zijn de afwezigheid van chemische resten en de negatieve effecten van hoge temperaturen. Koude sterilisatie heeft echter beperkt nut omdat niet alle materialen en apparatuur zulke lage temperaturen kunnen weerstaan. De werkwijze is effectief voor het steriliseren van thermolabiele stoffen en materialen.